Como ya vimos anteriormente, las enzimas están involucradas en las transformaciones químicas de muchas moléculas esenciales de la naturaleza. Así, el estudio de su actividad nos da mucha información sobre el estado metabólico de un sistema, que en muchos casos se relaciona directamente con su actividad biológica. Concretamente para los suelos agrícolas, las actividades enzimáticas más estudiadas son las oxidoreductasas (como las deshidrogenasas, catalasas y peroxidasas) y las hidrolasas que intervienen en los principales ciclos de nutrientes (carbono, nitrógeno, fósforo y azufre), tal y como podemos ver en la siguiente figura:
Muchas de las enzimas comentadas son de origen microbiano y las podemos clasificar en dos grandes grupos:
- Las intracelulares. Son las que están dentro de las células vivas por lo que su función se desarrolla una vez que entren los sustratos en las células.
- Las extracelulares. Las que se excretan al medio o las que se liberan después de la lisis celular al morir dichas células. Estas últimas pueden estar libres en el medio o inmobilizadas en los complejos arcillosos o en las sustancias húmicas. En la siguiente figura, se puede ver más información sobre los tipos y el origen de las mismas.
Para conocer más, no dudéis en leer el siguiente DOCUMENTO
Cálculo de las actividades enzimáticas en el compost
ACTIVIDAD DESHIDROGENSA
Se determina la actividad deshidrogenasa descrita por García y col. (1997), midiendo el resultado bajo la forma de producción de INTF en los composts molidos homogéneamente, tras una incubación con exceso de INT como sustrato.
Reactivos:
– INT (R.A.), (2-[4-iodophenyl)-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazolium chloride).
– INTF (R.A.), (Iodonitrotetrazolium violet-formazan), Pm: 471.25 g mol-1.
– Tetracloroetileno.
– Acetona.
Procedimiento:
Se pesa 0,5 g de compost con precisión de 0,0001g en tubos de vidrio con rosca específicos para esta actividad (nota: no se deben lavar nunca con jabón, solo con abundante agua y con ácido). Además, se deben pesar blancos (nota: con el fin de determinar la interferencia de la matriz y del exceso de sustrato añadido). Se recomienda como mínimo 4 réplicas de cada muestra.
A continuación, y como las muestras están liofilizadas, se le añade agua destilada hasta llegar al 60% de su capacidad de retención hídrica (se calcula previamente mediante adición de agua hasta saturación de la misma).
Después, a todas las muestras se le añade 0,2 ml de agua destilada, 0,2 ml de INT al 0,4% (nota: disolver el INT en 1 ml dimetilformamida (DFM) y enrasar con agua destilada hasta el volumen deseado), menos a los blancos que se les añade 0,2 ml de agua destilada. Se homogeniza bien la mezcla agitando levemente.
A continuación se incuban las muestras durante 20 horas en oscuridad manteniendo la temperatura a 20ºC sin agitación mecánica.
Pasado este tiempo, se le añade a todas las muestras 5 ml de la mezcla extractora (tetracloroetileno/acetona en una proporción 1/1,5), agitando vigorosamente durante 2 min. Se centrifuga a 3000 rpm durante 10 minutos y se filtra con papel lavado a los ácidos.
Finalmente se lee en espectrofotómetro a 490 nm, utilizando cubetas de cuarzo. Los resultados se dan en µmol INTF g-1 h-1, teniendo en cuenta que el volumen final de reacción son 5ml.
Preparación de la curva de calibrado.
Se prepara una curva de calibrado con una solución patrón de INTF de 100 ppm y se preparan sucesivamente diluciones de 40, 20, 10, 7´5, 5, 2,5 y 0 ppm. Todas las disoluciones se preparan utilizando la mezcla extractora tetracloroetileno/acetona como disolvente.
ACTIVIDAD UREASA
Se determina la actividad ureasa descrita por Nannipieri y col. (1996) midiendo el resultado bajo la forma de producción de NH4+ en los composts molidos homogéneamente, tras una incubación con exceso de urea como sustrato.
Reactivos:
– Urea (R.A.)
– Tampón fosfato (pH: 7.1):
– Solución A: 15.60 g de NaH2PO4 x 2H2O en 1000 ml de agua destilada.
– Solución B: 17.80 g de Na2HPO4 x 2H2O en 1000 ml de agua destilada.
– Tampón fosfato: 39 ml de solución A, 61 ml de solución B y 100 ml de agua destilada.
Procedimiento:
Se pesa 1 g de compost con precisión de 0,0001g en tubos de vidrio con rosca específicos para esta actividad (nota: no se deben lavar nunca con jabón, solo con abundante agua y con ácido). Además, se deben pesar blancos (nota: con el fin de determinar la interferencia de la matriz y del exceso de sustrato añadido). Se recomienda como mínimo 4 réplicas de cada muestra.
Después, a todas las muestras se le añade 2 ml de tampón fosfato (pH: 7,1) y 0,5 ml de Urea al 6,4% (3.2 g en 50 ml). A los blancos, en vez de añadir Urea se le añade 0,5 ml de agua destilada.
A continuación se incuban las muestras durante 2 horas en un baño termostatizado con un sistema de agitación horizontal incorporado manteniendo la temperatura a 37ºC.
Pasado este tiempo, se le añade a todas las muestras 7,5 ml de agua destilada obteniendo así un volumen final de 10 ml, centrifugándose durante 10 minutos a 3500 rpm y se filtra con papel lavado a los ácidos.
Finalmente, se determina el contenido en NH4+ tal y como se detalla a continuación. Los resultados se expresan como µmol NH4+ g-1 h-1.
Determinación de amonio (NH4+).
Se realizó una medida espectrofotométrica de la intensidad de coloración verde del complejo producido al reaccionar con salicilato sódico en presencia de dicloroisocianurato sódico como fuente de cloro, nitroprusiato sódico como catalizador (Sommers y col., 1992) y citrato sódico como complejante de calcio y magnesio para evitar su precipitación como hidróxidos a valores de pH mayores de 12 (Kempers y Zweers, 1986).
Reactivos:
.
-Reactivo A (preparar diariamente): se disuelven 7,813 g de salicilato sódico (R.A.) y 25 mg de nitroprusiato sódico (R.A.), y se enrasan juntos a 100 ml con agua desionizada.
-Reactivo B: se disuelven 4,0 g de NaOH y se adiciona 0,5 g de dicloroisocianurato sódico (R.A.), se enrasan juntos a 100 ml con agua desionizada (pH 13).
-Reactivo C: se disuelven 9,33 g de citrato sódico (R.A.) y se enrasan a 100 ml con agua desionizada.
Procedimiento:
La recta patrón se construye a partir de una de disolución de (NH4)2SO4 (1,880 g de (NH4)2SO4 y se lleva a 1.000 ml con agua desionizada) que contiene aproximadamente 400 ppm de NH4+ y se obtienen disoluciones que contengan exactamente 5, 10, 15, 20 y 25 ppm del mismo. Para la determinación del NH4+ se toman 0,4 ml del extracto problema o de las disoluciones patrón, y se añaden 1,6 ml de reactivo A, 6,4 ml de agua desionizada, 0,8 ml de reactivo B y 0,8 ml de reactivo C. Se mezcla bien y se deja en reposo en la oscuridad durante 45 minutos para un adecuado desarrollo del color. Pasado este tiempo, se mide en el espectrofotómetro la absorbancia a λ= 660 nm y se determina la concentración de NH4+ respecto a la recta patrón.
ACTIVIDAD β-GLUCOSIDASA
Se determina la actividad β-glucosidasa descrita por Tabatabai (1982) midiendo el resultado bajo la forma de producción de PNP en los compost tras una incubación con exceso de PNG como sustrato.
Reactivos:
– PNG (R.A.), (4-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside, 99%).
– PNP (R.A.), (p-nitrophenol).
– Tampón maleato (0,1M, pH: 6,5):
– Solución A: 0.1 M de solución de maleato sódico (4 g de NaOH + 11,6 g de ácido maléico en 1000 ml de agua destilada)
– Solución B: 0.1 M NaOH (4 g de NaOH en 1000 ml de agua destilada)
– Tampón maleato: 50 ml de solución A, 39 ml de solución B y 111 ml de agua destilada.
– CaCl2
– NaOH
Procedimiento:
Se pesa 0,5 g de compost con precisión de 0.0001g en tubos de vidrio con rosca específicos para esta actividad (nota: no se deben lavar nunca con jabón, solo con abundante agua y con ácido). Además, se deben pesar blancos (nota: con el fin de determinar la interferencia de la matriz y del exceso de sustrato añadido). Se recomienda como mínimo 4 réplicas de cada muestra.
Después, a todas las muestras se le añade 2 ml de tampón maleato (pH: 6,5) y 0,5 ml de PNG 50mM (0.30125 g en 20 ml). A los blancos, solo se le añade los 2 ml de tampón maleato.
A continuación se incuban las muestras durante 2 horas en un baño termostatizado con un sistema de agitación horizontal incorporado manteniendo la temperatura a 37ºC.
Pasado este tiempo, se le añade a los blancos 0,5 ml de PNG. Además, a todas las muestras se le añaden 0,5 ml de CaCl2 0,5M y 2ml de NaOH 0,1M, obteniendo un volumen final de 5 ml. Después, se centrifuga durante 10 minutos a 3500 rpm y se filtra con papel lavado a los ácidos.
Finalmente, se determina el contenido en PNP tal y como se detalla a continuación. Los resultados se expresan como µmol PNP g-1 h-1.
Preparación de la curva de calibrado.
Preparamos una solución de 1000 ppm de PNP (0,1 g de PNP en 100 ml de agua destilada). PNP es 4-nitrofenol, cuyo peso molecular es 139,11 g mol -1 (C6H5NO3). A continuación, se preparan siguientes puntos de la curva 0, 5, 10, 20, 40 y 80 ppm, mediante las correspondientes diluciones.
A continuación, se ponen 0,5ml de las diferentes concentraciones de PNP + 2ml de tampón maleato + 0,5ml de CaCl2 0,5M + 2ml NaOH 0,1M y se mide la Absorbancia a 398nm. Para las muestras se opera de la misma forma.
ACTIVIDAD FOSFOSATA
Se determina la actividad fosfatasa descrita por Tabatabai y col. (1962) midiendo el resultado bajo la forma de producción de PNP en los composts molidos homogéneamente, tras una incubación con exceso de PNPP como sustrato.
Reactivos:
– PNPP (R.A.), (4-nitrophenyl phosphate disodium salt, hexahydrate, 98%).
– PNP (R.A.), (p-nitrophenol).
– Tampón maleato (0,1M, pH: 6,5):
– Solución A: 0.1 M de solución de ácido maleato sódico (4 g de NaOH + 11,6 g de Ac. Maléico en 1000 ml de agua destilada)
– Solución B: 0.1 M NaOH (4 g de NaOH en 1000 ml de agua destilada)
– Tampón maleato: 50 ml de solución A, 39 ml de solución B y 111 ml de agua destilada.
– CaCl2
– NaOH
Procedimiento:
Se pesa 0,5 g de compost con precisión de 0,0001g en tubos de vidrio con rosca específicos para esta actividad (nota: no se deben lavar nunca con jabón, solo con abundante agua y con ácido). Además, se deben pesar blancos (nota: con el fin de determinar la interferencia de la matriz y del exceso de sustrato añadido). Se recomienda como mínimo 4 réplicas de cada muestra.
Después, a todas las muestras se le añade 2 ml de tampón maleato (pH: 6,5) y 0,5 ml de PNPP 0,115mM (2.1333 g en 50 ml). A los blancos, solo se le añade los 2 ml de tampón maleato.
A continuación se incuban las muestras durante 2 horas en un baño termostatizado con un sistema de agitación horizontal incorporado manteniendo la temperatura a 37ºC.
Pasado este tiempo, se le añade a los blancos 0,5 ml de PNPP. Además, a todas las muestras se le añaden 0,5 ml de CaCl2 0,5M y 2ml de NaOH 0,1M, obteniendo un volumen final de 5 ml. Después, se centrifuga durante 10 minutos a 3500 rpm y se filtra con papel lavado a los ácidos.
Finalmente, se determina el contenido en PNP tal y como se detalla a continuación. Los resultados se expresan como µmol PNP g-1 h-1.
Preparación de la curva de calibrado.
Preparamos una solución de 1000 ppm de PNP (0,1 g de PNP en 100 ml de agua destilada). PNP es 4-nitrofenol, cuyo peso molecular es 139,11 g mol -1 (C6H5NO3). A continuación, se preparan siguientes puntos de la curva 0, 5, 10, 20, 40 y 80 ppm, mediante las correspondientes diluciones.
A continuación, se ponen 0,5ml de las diferentes concentraciones de PNP + 2ml de tampón maleato + 0,5ml de CaCl2 0,5M + 2ml NaOH 0,1M y se mide la Absorbancia a 398nm. Para las muestras se opera de la misma forma.
ACTIVIDAD ARILSULFATASA
Se determina la actividad arilfosfatasa descrita por Tabatabai y Bremner (1970) midiendo el resultado bajo la forma de producción de PNP en los composts molidos homogéneamente, tras una incubación con exceso de PNPP como sustrato.
Reactivos:
– PNPS (R.A.), (p-nitrophenyl sulphate).
– PNP (R.A.), (p-nitrophenol).
– Tampón acetato (0,5M, pH: 5,8):
– Se pesan 0.2457 g de ácido acético y 0.6248 g de acetato sódico trihidrato enrasando a un volumen final de 100 ml de agua destilada.
– CaCl2
– NaOH
Procedimiento:
Se pesa 1 g de compost con precisión de 0,0001g en tubos de vidrio con rosca específicos para esta actividad (nota: no se deben lavar nunca con jabón, solo con abundante agua y con ácido). Además, se deben pesar blancos (nota: con el fin de determinar la interferencia de la matriz y del exceso de sustrato añadido). Se recomienda como mínimo 4 réplicas de cada muestra.
Después, a todas las muestras se le añade 4 ml de tampón acetato (pH: 5,8) y 1 ml de PNPS 20 mM (0.5146 g en 100 ml). A los blancos, solo se le añade los 4 ml de tampón acetato.
A continuación se incuban las muestras durante 5 horas en un baño termostatizado con un sistema de agitación horizontal incorporado manteniendo la temperatura a 20ºC.
Pasado este tiempo, se le añade a los blancos 1 ml de PNPS. Además, a todas las muestras se le añaden 1 ml de CaCl2 0,5M y 4ml de NaOH 0,1M, obteniendo un volumen final de 10 ml. Después, se centrifuga durante 10 minutos a 3500 rpm y se filtra con papel lavado a los ácidos.
Finalmente, se determina el contenido en PNP tal y como se detalla a continuación. Los resultados se expresan como µmol PNP g-1 h-1.
Preparación de la curva de calibrado.
Preparamos una solución de 1000 ppm de PNP (0,1 g de PNP en 100 ml de agua destilada). PNP es 4-nitrofenol, cuyo peso molecular es 139,11 g mol -1 (C6H5NO3). A continuación, se preparan siguientes puntos de la curva 0, 5, 10, 20, 40 y 80 ppm, mediante las correspondientes diluciones.
A continuación, se ponen 0,5ml de las diferentes concentraciones de PNP + 2ml de tampón maleato + 0,5ml de CaCl2 0,5M + 2ml NaOH 0,1M y se mide la Absorbancia a 398nm. Para las muestras se opera de la misma forma.
ACTIVIDAD PROTEASA-BAA
Se determina la actividad proteasa-BAA descrita por Nannipieri y col. (1980) midiendo el resultado bajo la forma de producción de NH4+ en los composts molidos homogéneamente, tras una incubación con exceso de BAA como sustrato.
Reactivos:
– BAA (R.A.), (N-α-Benzoyl-l-argininamide). C13H19N5O2•HCl•H2O F.W. 331.80 CAS: 965-03-7 (Sigma B4375).
– Tampón fosfato (0,1M, pH: 7.1):
– Solución A: 15.60 g de NaH2PO4 x 2H2O en 1000 ml de agua destilada.
– Solución B: 17.80 g de Na2HPO4 x 2H2O en 1000 ml de agua destilada.
– Tampón fosfato: 39 ml de solución A, 61 ml de solución B y 100 ml de agua destilada.
– HCl 5M.
Procedimiento:
Se pesa 0.5 g de compost con precisión de 0,0001g en tubos de vidrio con rosca específicos para esta actividad (nota: no se deben lavar nunca con jabón, solo con abundante agua y con ácido). Además, se deben pesar blancos (nota: con el fin de determinar la interferencia de la matriz y del exceso de sustrato añadido). Se recomienda como mínimo 4 réplicas de cada muestra.
Después, a todas las muestras se le añade 2 ml de tampón fosfato (pH: 7,1) y 0,5 ml de BAA 0,03M (0.4977 g de BAA con 50ml de tampón fosfato, preparación diaria). A los blancos, en vez de añadir BAA se le añade 0,5 ml de agua destilada.
A continuación se incuban las muestras durante 1,5 horas en un baño termostatizado con un sistema de agitación horizontal incorporado manteniendo la temperatura a 39ºC.
Pasado este tiempo, para parar la incubación, se le añade a todas las muestras 0,4ml de HCl 5M y 7,1 ml de agua destilada, obteniendo un volumen final de 10 ml. Después, se centrifuga durante 15 minutos a 3500 rpm y se filtra con papel lavado a los ácidos.
Finalmente, se determina el contenido en NH4+ tal y como se detalla a continuación. Los resultados se expresan como µmol NH4+ g-1 h-1.
Determinación de amonio (NH4+).
Se realizó una medida espectrofotométrica de la intensidad de coloración verde del complejo producido al reaccionar con salicilato sódico en presencia de dicloroisocianurato sódico como fuente de cloro, nitroprusiato sódico como catalizador (Sommers y col., 1992) y citrato sódico como complejante de calcio y magnesio para evitar su precipitación como hidróxidos a valores de pH mayores de 12 (Kempers y Zweers, 1986).
Reactivos:
.
-Reactivo A (preparar diariamente): se disuelven 7,813 g de salicilato sódico (R.A.) y 25 mg de nitroprusiato sódico (R.A.), y se enrasan juntos a 100 ml con agua desionizada.
-Reactivo B: se disuelven 4,0 g de NaOH y se adiciona 0,5 g de dicloroisocianurato sódico (R.A.), se enrasan juntos a 100 ml con agua desionizada (pH 13).
-Reactivo C: se disuelven 9,33 g de citrato sódico (R.A.) y se enrasan a 100 ml con agua desionizada.
Procedimiento:
La recta patrón se construye a partir de una de disolución de (NH4)2SO4 (1,880 g de (NH4)2SO4 y se lleva a 1.000 ml con agua desionizada) que contiene aproximadamente 400 ppm de NH4+ y se obtienen disoluciones que contengan exactamente 5, 10, 15, 20 y 25 ppm del mismo. Para la determinación del NH4+ se toman 0,4 ml del extracto problema o de las disoluciones patrón, y se añaden 1,6 ml de reactivo A, 6,4 ml de agua desionizada, 0,8 ml de reactivo B y 0,8 ml de reactivo C. Se mezcla bien y se deja en reposo en la oscuridad durante 45 minutos para un adecuado desarrollo del color. Pasado este tiempo, se mide en el espectrofotómetro la absorbancia a λ= 660 nm y se determina la concentración de NH4+ respecto a la recta patrón.
BIBLIOGRAFÍA:
Deshidrogenasa
C. García, M.T. Hernández and F. Costa, Potential use of dehydrogenase activity as an index of microbial activity in degraded soils, Commun. Soil Sci. Plant Anal 28 (1997), pp. 123–134.
Proteasa
P. Nannipieri, B. Ceccanti, S. Cervelli and E. Matarese, Extraction of phosphatase, urease, protease, organic carbon and nitrogen from soil, Soil Sci. Soc. Am. J 44 (1980), pp. 1011–1016.
Ureasa
P. Nannipieri, P. Sequi and P. Fusi, Humus and enzyme activity In: A. Piccolo, Editors, Humus Substances in Terrestrial Ecosystems, Elsevier, Amsterdam, Netherlands (1996), pp. 293–328.
Fosfatasa y glucosidasa
M.A. Tabatabai and J.M. Bremner, Use of p-nitrophenol phosphate in assay of soil phosphatase activity, Soil Biol. Biochem 1 (1969), pp. 301–307.
M.A. Tabatabai, Soil enzymes. In: A.L. Page, E.M. Miller and D.R. Keeney, Editors, Methods of Soil Analysis, ASA and SSSA, Madison, WI (1982), pp. 501–538.
Arilsulfatasa
Amonio
Kempers, A. J. & Zweers, A. (1986). Ammonium determination in soil extracts by the salicylate method. Communications in Soil Science and Plant Analysis., 17, 715-723.
Sommers, S. G., Kjellerup, V. & Kristjansen, O. (1992). Determination of total ammonium nitrogen in pig and cattle slurry: sample preparation and analysis. Acta Agric. Scand. Sect. B, Soil Plant Science., 42, 146-151.
Para completar:
TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE PARÁMETROS BIOQUÍMICOS EN SUELOS: MEDIDAS DE ACTIVIDADES ENZIMÁTIAS Y BIOMASA MICROBIANA. Mundiprensa. Madrid , 2003. ISBN: 9788484761549. AUTORES: García, Carlos & Gil, Fernando & Hernández, Teresa & Trasar, Carmen
